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酵素测定-蛋白質定量法︰  

2014-11-18 08:04:06|  分类: 酵素日记 |  标签: |举报 |字号 订阅

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1  蛋白質定量法︰
請注意以下三點蛋白質定量的基本問題。

a. 蛋白質量與酵素活性不一定成正比

酵素是一種蛋白質,因此測定純質酵素樣本中的蛋白質量,大致可以說是該酵素的含量。 但須注意酵素是具有活性的分子,蛋白質含量很高的,不見得活性就高。

■ 各種定量法的比較

b. 慎選標準品

蛋白質定量需要一已知的標準品,以求得標準曲線;一般採用 白蛋白 (albumin) 或 免疫球蛋白 (immunoglobulin),使用不同的標準品所得到的結果,會有相當大的差異。

 
c. 注意干擾因子

樣本中的雜質或緩衝液可能會影響測定,因此濃度較高的樣本,所得結果可能會錯估;通常稀釋倍數較大的樣本,其所含干擾物質少,測定值比較可靠。

 

1.1  Biuret 法:
銅離子在鹼性溶液中,會與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合,生成紫色的複合物;兩個 carbonyl 與一個銅離子結合成類似 biuret 的複合体。 其 精確度 較差 (數 mg),且會受樣本中 硫酸銨 及 Tris 的干擾,但 準確度 較高,不受蛋白質的種類影響。由 Biuret 法更發展出較靈敏的 BCA (bicinchoninic acid) 呈色劑,使精確度大大提升。

■ 精確度與準確度

1.2  Lowry 法:
是上述 biuret 法的延伸,當銅離子與胜鏈形成複合物後,可再與 Folin-Ciocalteau 試劑的 phosphomolybdic-phosphotungstate 作用產生藍色物質,更為靈敏 (約 0.1 mg),但較麻煩,也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合,要特別注意均勻澈底,否則會有大誤差。

 
 1.3  UV 吸光法:

a. 胺基酸的 芳香基團 在 280 nm 有吸光,蛋白質胜鏈骨架上的基團在 200 nm 附近有吸光。 由於各種蛋白質所含芳香族胺基酸組成不一,它們在 280 nm 的吸光能力亦不同,可以 分子消光係數 (molar extinction coefficient) 來表示。

 
b. 一般以 E (1%, 280 nm) 來表示,大部分蛋白質在 4-15 間 (平均為 10)。 若某蛋白質的 E 值為 10,其溶液在 280 nm 吸光值為 1,則此蛋白質溶液的濃度為 1 mg/mL。可以下式計算︰     吸光值 = E × b × c

(c 為蛋白質 % 濃度,即每 100 mL 所含蛋白質的克數;b 為光徑 1 cm)

■ 分子消光係數

  
c. 此法只有在蛋白質純度很高時,才能精確測定;但若將蛋白質的 E 值大概定為 10,則對粗抽取液的略估相當方便:在 280 nm 的吸光值為 1 時,濃度約為 1 mg/mL。

■ 蛋白質的分子消光係數

1.4  Coomassie Blue (dye binding) 法: Bradford Method
Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG) 在 過氯酸 溶液中呈 紅棕色,但與蛋白質結合後則變成 藍色,呈色可測 595 nm 波長的吸光。 此法方便靈敏 (數十 mg),且可使用 微量滴定盤 進行分析,降低試劑用量,方便大量樣本的操作。

■ Bradford 定量法

◆ Bio-Rad

1.5  其他方法:


有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團,如 peroxidase 含有 heme 基團,可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酵素 (如鎘),則可追蹤該金屬。

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圖 1.1  各種蛋白質定量方法所依據的原理     ■ 比較蛋白質染色法
目標蛋白質在中央以捲繞的粗線表示,其上並標出蛋白質的脊骨 (-N-C-C-N-C-C-),連同胺基酸上的各種官能基團 (Lys, Arg, Tyr 等),都可被利用來作為定量之用。

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